PROGRAMA DE LA ASIGNATURA

GENÉTICA  2

OPCIÓN: BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

I.    DESCRIPCIÓN

1. UBICACIÓN DENTRO DE LA LICENCIATURA

Se trata de una asignatura teórico-práctica  perteneciente a la Opción Biología Experimental dentro del Pensum de la Lic. Biología, Facultad de Ciencias de la ULA.

2. DURACIÓN Y UNIDADES CRÉDITOS

   El tiempo de duración es de un semestre (apróx. 16 semanas efectivas de clase). tiene asignado un total de 6 unidades créditos, equivalentes a 9 hs/semana: 3 hs. de Teoría y 6 hs. de Laboratorio.

3. OBJETIVOS GENERALES

Se desarrolla como un curso dirigido al estudio de sistemas procariotas. Está concebido con el propósito de aportar conocimientos básicos que le permitan a los cursantes iniciarse en el manejo y aplicación de las manipulaciones genéticas, con fines científicos y/o de aplicación práctica y en la Biotecnología.

En ese sentido, se estudian las propiedades genético-fisiológicas de ciertos elementos extracrosomales naturales que han sido el soporte biológico clave en el desarrollo y progreso de las manipulaciones genéticas.

II.   PROGRAMA TEÓRICO

1. OBJETIVOS

Está dirigido hacia el estudio de tres grandes aspectos:

1. Los elementos genéticos utilizados en la construcción de los sistemas huésped-hospedador para propiciar arreglos cromosomales, modificar el patrimonio genético de las especies, obtener fusión de genes, clonaje de genes particulares y su expresión, etc. Para ello se presentan los modelos de organización estructural y funcional de los elementos genéticos móviles (IS, Tn, Fago Mu), plásmidos y  episomas (fago, factor F, factores R y Col); se consideran las interacciones genéticas propias y las que se establecen entre unos y otros, y con el  hospedador.

2. Los mecanismos moleculares que participan en la transferencia de la información genética (transformación, transferencia, conjugación), mantenimiento estable en el hospedador receptor (sistema de restricción-modificación, mecanismos de recombinación genética), posterior transmisión a la descendencia filial (heredabilidad estable).

3. Las metodologías utilizadas en las manipulaciones genéticas, tanto "in vivo" como "in vitro". Se discuten comparativamente las bases teóricas, aplicación, alcances y limitaciones. La utilidad de los elementos genéticos móviles y plásmidos en las técnicas de recombinación genética.

 

2. CONTENIDO PROGRAMÁTICO

El programa está estructurado en dos partes, las cuales secuencialmente son las siguientes:

PARTE I.   ESTUDIOS GENÉTICOS Y FISIOLÓGICOS DE LOS ELEMENTOS EXTRACROSOMALES.

1. Elementos móviles o transponibles. Descubrimiento. Clasificación de los elementos IS, Tn y Mu. Propiedades generales. Organización genética y funcional. Expresión de sus genes y regulación. Mecanismos de movilización integrativa y regulación del proceso. Integración mutagénica y sus efectos: aberraciones cromosomales, polaridad, terminación de transcripción y cambios en los mecanismos de regulación. Comparación con la mutagénesis química.  Ejemplos de elementos móviles en eucariotas. Origen e importancia evolutiva de los elementos móviles.

2. El fago como modelo de diferenciación celular. Ciclo de vida. Mapa genético lineal del fago. Organización funcional y transcripción de los genes: localización de promotores, operadores, señales de  terminación y genes inmediatamente tempranos, tempranos y tardios. Regulación de la expresión  genética. Proteínas reguladoras y su modo de acción. Funciones aportadas por el huésped. Control de la síntesis del represor: establecimiento y mantenimiento de la lisogenia. Circuitos de control positivo y negativo durante el desarrollo lítico: funciones inmediatamente tempranas, tempranas y tardias.  Lisogenia e inducción del profago. Participación de la proteína recA y del sistema SOS. Replicación del ADN del fago: modos de replicación y funciones involucradas.

3. F como modelo de factor sexual. Propiedades generales. Organización genética y funcional del genoma  de F. Sistema genético involucrado en la transferencia de F por conjugación. Movilización de  marcadores cromosomales mediada por F y funciones involucradas. Transmisión del factor F: replicación vegetativa y su regulación. Incompatibilidad entre factores F y otros plásmidos. Exclusión de superficie.

4. Factores R y factores Col. Origen y clasificación. Importancia médica y ecológica. Organización genética y funcional. Factores R: genes de resistencia a drogas, control genético y mecanismo de resistencia; participación de los Tn. Factores Col: síntesis de colicina y su modo de acción. Fenómenos  de inmunidad, resistencia y tolerancia. Mantenimiento y transmisión de los factores R y Col: replicación vegetativa y funciones involucradas; curación. Interacción entre plásmidos. Transferencia conjugacional e inhibición de la fertilidad (fi): sistema genético involucrado y mutantes drd. Formación de cointegrados:  papel de los elementos IS y Tn. Movilización de plásmidos Tra.

5. Transformación y transfección como procesos de transferencia de información genética. Cinética de transformación y eficiencia de este proceso. Competencia  de poblaciones bacterianas. Entrada del  ADN donante y su expresión. Barreras genéticas: sistemas de restricción y modificación. Mutantes del sistema y métodos de selección. Enzimas de restricción conocidas, modo de acción y utilidad  en las  manipulaciones genéticas "in vitro".

6. Integración de la información genética en el genoma hospedador. Recombinación generalizada: modelos propuestos a nivel molecular, funciones involucradas y papel de la proteína recA. Comparación con el sistema de recombinación general red del fago. Procesos de recombinación aditiva. Modelo de Campbell para la integración específica y escisión del ADN de.  Funciones involucradas. Mecanismo  de integración y escisión del factor F y formación de cepas Hfr. Mecanismos de formación de partículas transductantes del fago y factores F de la cabeza y de la cola. Comparación con la  movilización integrativa (por  transposición o translocación) de los IS, Tn y del fago Mu.

 

PARTE II.      MANIPULACIONES GENÉTICAS EN PROCARIOTAS:

1. Técnicas de Ingeniería Genética "in vitro": posibilidad de introducir ADN extranjero en una célula  receptora. Necesidad de vehículos de clonaje o vectores. Propiedades de los vectores y de la célula receptora. Utilidad  de los fagos y plásmidos. Fabricación de nuevos vectores, Métodos para obtener preparaciones de ADN. Métodos de clonaje para la obtención de moléculas de ADN híbridas o quimeras por recombinación  "in vitro": utilidad de las enzimas de restricción, transferasas terminales y ligasas. Introducción del ADN quimera en células receptoras biológicamente funcionales (transformación y/o transfección) y selección de las células recombinantes que recibieron el clon. Métodos genéticos y ventajas de utilizar marcadores fenotípicos. Demostración de la presencia del clon. Métodos bioquímicos de selección. Métodos para la amplificación del clon. Ejemplos de clonaje de genes eucariotas en vectores procariotas y/o eucariotas y selección. Métodos de secuenciamiento de ADN y construcción de genotecas. Técnicas bioquímicas y de Biología Molecular de utilidad en las manipulaciones genéticas.

2. Técnicas de Endo-Ingeniería Genética. Empleo de los elementos genéticos extracromosomales en el clonaje "in vivo": fagos atemperados (080, Mu), plásmidos y transposones. Utilidad de los  transposones en una variedad de otras manipulaciones genéticas "in vivo". Fusión de genes y proteínas  mediada por el fago Mu. ejemplos de procesos involucrados en la transferencia de genes "in vivo" entre organismos procariotas y eucariotas: plásmido Ti de Agrobacterium.

 

III. PROGRAMA DE LABORATORIO

1. OBJETIVOS

Suministrar conocimientos teórico-experimental sobre el manejo de microorganismos y elementos extracromosomales procariotas, además de las metodologías fundamentales en Biología Molecular que son de utilidad en las manipulaciones genéticas y en Biotecnología.

2. CONTENIDO PROGRAMÁTICO

Los conocimientos serán aplicados en el desarrollo de un pequeño proyecto de investigación experimental. El contenido del proyecto puede ser variable, no obstante, la selección del tema a desarrollar contempla aspectos genéticos, fisiológicos y bioquímicos descritos en el programa del curso teórico.

IV. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.

Se utilizan LIBROS Y MANUALES DE LABORATORIO elaborados con fines didácticos. No obstante, la mayor parte de la bibliografía que se maneja son trabajados originales publicados en revistas científicas. La descripción de la bibliografía es suministrada a lo largo del curso.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA PARA GENÉTICA II

Semestre B-94

(Trabajos prácticos)

1. Way et al. (1984). Gene 32: 369-79. New Tn10 derivates for transposon mutagenesis and for construction of lacZ operon fusions by transposition.
   

2. Silhavy et al. (1984). Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory.
   

3. Miller (1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory.
   

4. Kleckner et al. (1977). J. Mol. Biol. 116: 125. Genetic engineering in vivo using translocatable drug resistance elements. New methods in bacterial genetics.
   

5. Eds. Grinsted and Bennet (1988). Methods in Microbiology, Vol. 21, 2nda. Edition, Academic Press.
   

6. Ed. Miller (1991). Methods in Enzymology. Bacterial Genetic Systems, Vol. 204, Academic Press.
   

7. Ed. Balows et al. (1992). The Prokaryotes, 2nda. Edition, Springer-Verlag.
   

8. Rieger et al. (1991). Glossary of Genetics. Classical and Molecular, 5ta. Edition, Springer-Verlag.
   

9. Miller (1992). A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
   

10. Bachmann (1990). Microbiol. Rev. 54: 130-197. Linkage map of Escherichia coli.
    

11. Singer et al. (1989). Microbiol. Rev. 53: 1-24. A collection of strains containing genetically linked alternating antibiotic resistance elements for genetic mapping of Escherichia coli.
    

12. Smbrook et al. (1989). molecular Cloning. A laboratory manual, 2nda. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
    
    

13. Chauthaiwale et al. (1992). Microbiol. Rev. 56: 577-591. Bacteriophage lambda as a cloning vector.
    

14. Silhavy and Beckwith (1985). microbiol. Rev. 49: 398-418. Uses of lac fusions for the study of biological problema.
    

15. Manoil (1990). J. Bacteriol. 172: 1035-1042. Analysis of protein localization by use of gene fusions with complementary properties.
    

16. Choe and Reznikoff (1991). J. teril. 173: 6139-6146. Anaerobically expressed Escherichia coli genes identified by operon fusion techniques.
    

17. Bremer et al. (1985). J. Bacteriol. 162: 1092-1099. Transposable lambda placMu bacteriophages for creating lacZ operon fusions and Kanamycin resistance insertions in Escherichia coli.

TEXTOS  RECOMENDADOS PARA GENÉTICA II

• Beckwith. J. & D. Zipser. (Eds.). The lactose operon. Cold Spring Harbor laboratory. 1970.

• Davis. R., D. Botstein & J. Roth. (Eds.) Advanced Bacterial Genetic. Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1980.

• Freifelder. D. Técnicas de Bioquímica y Biologia Molecular. Ed. Reverte. S.A., 1979.

• Grinsted J. & Bennett P. (Eds.) Methods in Microbiology: Plasmis Technology, Academic Press. Vol. 21, 19 2nda. Ed., 1988.

• Lewin B. Gene Expressions: Bacterial genomes. Jhon Wiley & Sons, London, Vol. 1, 1975.

• Lewin B. Gene Expressions-3: Plasmids & Phages. Jhon Wiley & Sons, London, Vol. 3, 1977.

• Lewin B. Gene Expressions. Jhon Wiley & Sons, London, 2nda. Ed., 1985.

• Lewin B. Genes IV. Cell Press. Mass. Oxford University Press. Walton Street, Oxford OX2 6DP. 1990.

• Lewin B. Genes. Editorial Reverté. S.A. (versión española de Genes, 3ra. Ed.), 1991.

• Bukhari A. Shapiro J. & Adhya S. DNA inserion elements. plasmids and episomes. Cold Spring Harbor Laboratory.

• Cold Spring Harbor, New York, 1977.

• Miller, J.H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972.

• Miller J. A Short course in Bacterial Genetics. cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992.

• Rieger R., A. Michaelis & Green M. Glossary: Classical and Molecular. Ed. Spring-Verlag. Berlin Heidelberg NY. 7ta. Ed., 1991.

• Symonds N., A. Toussaint, P Van de Putte & M. Home (Eds.). Phage Mu, Cold Spring Harbor Laboratory, Cols Spring Harbor, N.Y., 1987.

• Ternynck Th. y Avrameas.  Técnicas inmunoenzimáticas, Grupo Editorial Iberoamericana, 1989.

• Towbin H. & J. Gordon. Immunoblotting and Dot Immunobinding, Current status and outlook. J. Immunol. Methods, 72: 313, 1984.

• Sambrook J., Fritsch & T. Maniatis.  Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. 2da. Ed.

• Serrano J. y García J: MAnual de Genética Molecular. Ed. Síntesis, 1990.

• Streips, U. & Yasbin, R. (Eds.). Modern Microbial Genetics, Willey-Liss, 1991.

• Methods in Enzymology, vol. 204, 1991.